Résumé
Cette note d'application présente un flux de travail entièrement automatisé pour la quantification précise de 73 PFAS dans les produits de la mer. Utilisant un passeur d'échantillons automatique PAL RTC et un système LC/MS à triple quadripôle Agilent (LC/TQ), la méthode automatise l'étalonnage, l'extraction QuEChERS et la purification µSPE. L'évaluation des performances sur l'ensemble des 73 PFAS démontre une sensibilité exceptionnelle, atteignant des limites de détection de la méthode (LDM) ≤ 10 ng/kg pour 28 PFAS réglementés par la FDA et des limites de quantification (LQ) validées ≤ 0,3 µg/kg pour 30 PFAS réglementés. En atteignant ou en dépassant les normes réglementaires internationales, ce système permet une analyse fiable et à haut débit des PFAS dans les produits de la mer et d'autres matrices complexes, contribuant ainsi à des initiatives cruciales de santé publique.
Figure 1. Étapes clés de la configuration et du flux de travail automatisé.
Les performances de la méthode sont conformes ou supérieures aux normes de la FDA américaine, de l'UE, des POP de l'EURL et de l'AOAC International.
Introduction
La contamination croissante des produits de la mer par les PFAS : un besoin d'analyses fiables et efficaces.
Les substances perfluoroalkylées et polyfluoroalkylées (PFAS) constituent un vaste groupe de produits chimiques de synthèse largement utilisés dans les produits industriels et de consommation en raison de leur résistance exceptionnelle à la chaleur, à l'eau et aux huiles. Cette même résistance les rend cependant extrêmement persistants dans l'environnement.
Les PFAS ne se dégradent pas facilement, ce qui entraîne leur accumulation dans les écosystèmes aquatiques et la contamination de la vie marine. Étant donné que les produits de la mer, tels que les poissons et les crustacés, peuvent absorber les PFAS, leur consommation par l'homme représente une voie d'exposition importante. Des études ont détecté des PFAS dans divers produits de la mer, notamment les palourdes, la morue, le crabe, le lieu noir, le saumon, les crevettes, le tilapia et le thon. Des enquêtes menées par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis ont révélé des niveaux détectables de PFAS dans un pourcentage considérable d'échantillons de produits de la mer.
La détection précise de traces de PFAS dans des matrices alimentaires complexes, comme les produits de la mer, présente d'importants défis analytiques.
La procédure analytique standard consiste à extraire les PFAS à l'aide de la méthode QuEChERS (rapide, facile, économique, efficace, robuste et sûre), suivie d'une étape de purification cruciale.
Traditionnellement, l'extraction en phase solide (SPE) est la technique de référence pour cette purification. Cependant, ces dernières années, la micro-extraction en phase solide (µSPE) s'est imposée comme une alternative performante offrant plusieurs avantages.
Bien que les techniques QuEChERS et SPE soient efficaces pour extraire une large gamme de composés des matrices alimentaires, le traitement manuel des échantillons est laborieux, chronophage et exige des analystes hautement qualifiés.
De plus, les procédures manuelles sont sujettes à des erreurs humaines, ce qui peut compromettre l'exactitude et la fiabilité des résultats. Les variations dans les techniques d'analyse peuvent également entraîner des incohérences, rendant particulièrement difficile l'obtention de la haute précision requise pour l'analyse des PFAS à l'état de traces.
Cette note d'application présente un flux de travail entièrement automatisé pour la quantification précise des PFAS dans les produits de la mer. La méthode utilise un passeur d'échantillons automatique PAL RTC (CTC Analytics AG) et un système LC/MS triple quadripôle Agilent 6495D (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem).
Le passeur d'échantillons automatique PAL RTC automatise l'ensemble du processus analytique, y compris l'extraction par solvant, le relargage QuEChERS et la purification de la cartouche d'extraction en phase solide micro (µSPE). L'analyse des données est effectuée en parallèle sur le système LC/TQ. Les performances de la méthode ont été évaluées de manière exhaustive par rapport aux normes et lignes directrices établies par le règlement (UE) 2023/915, le règlement (UE) 2022/1431, la liste des substances perméables à l'énergie (EURL POPs), la FDA américaine et la norme AOAC SMPR 2023.003.
Mesures réglementaires relatives aux PFAS dans les produits de la mer
Conscientes des risques pour la santé, les agences de réglementation du monde entier s'efforcent activement de comprendre l'étendue de la contamination des produits de la mer par les PFAS et d'établir des lignes directrices en matière de sécurité. Ces organismes comprennent la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA), le Laboratoire de référence de l'UE pour les polluants organiques persistants halogénés (EURL POPs) et l'Association of Official Analytical Chemists (AOAC) International.
Par exemple, le règlement (UE) 2022/1431, les lignes directrices de l'EURL POPs et les normes de l'AOAC exigent ou recommandent une limite de quantification (LQ) – la plus faible concentration mesurable de manière fiable – de 0,3 µg/kg pour quatre composés PFAS clés (PFOS, PFOA, PFNA et PFHxS) dans les produits de la mer.
La FDA américaine a également publié des données de validation des limites de détection des méthodes (LDM), exprimées en parties par billion (ppt), pour l'ensemble des 28 composés PFAS qu'elle réglemente dans les produits de la mer.
Résultats et discussion
Démonstration de hautes performances et exigences réglementaires
Afin de fournir une évaluation complète de la méthode automatisée, la section « Résultats et discussion » est structurée de manière à présenter les performances de la méthode, depuis l’étalonnage automatisé à l’analyse des échantillons.
Performances de l’étalonnage automatisé : linéarité, exactitude et précision
Les performances de la procédure d’étalonnage automatisée, couvrant une gamme de concentrations de 1 à 50 000 ng/l (ppt), ont été évaluées en fonction de la linéarité, de l’exactitude et de la précision.
Une excellente linéarité a été obtenue pour les 73 analytes, avec des valeurs de R²≥ 0,99 pour au moins cinq points d’étalonnage (sauf pour 10:2 FTCA et 8:2 FTCA, qui comportaient quatre points).
Les taux de récupération des composés de substitution sur toute la gamme d’étalonnage étaient compris entre 70 % et 130 %, et l’écart-type relatif (RSD) des réponses de l’étalon interne (ISTD) était ≤ 20 %. Ces résultats démontrent l'exactitude et la précision exceptionnelles des solutions étalons préparées par l'échantillonneur automatique PAL RTC.
La figure 2A illustre la linéarité du PFNA sur toute la gamme d'étalonnage (niveaux 1 à 12). La figure 2B présente les chromatogrammes MRM superposés du 13C9-PFNA (substitut du PFNA) des niveaux 1 à 12. La figure 2C présente les chromatogrammes MRM superposés du 13C2-PFOA (étalon interne du 13C9-PFNA) des niveaux 1 à 12. Ces figures confirment la précision et l'exactitude de la préparation automatisée des solutions étalons, garantissant ainsi la fiabilité et la robustesse du processus d'étalonnage.
L'automatisation de ce processus élimine les tâches manuelles fastidieuses, réduit le risque d'erreur humaine dans les analyses complexes, améliore le débit d'échantillons et assure des étalonnages cohérents et précis.
Figure 2. (A) La linéarité du PFNA couvrant toute la gamme d'étalonnage des niveaux 1 à 12 ; (B) la superposition MRM du 13C9-PFNA (substitut) des niveaux 1 à 12 ; (C) la superposition MRM du 13C2-PFOA (ISTD) des niveaux 1 à 12.
Sensibilité de la méthode : obtention de limites de détection et de quantification basses
La sensibilité du flux de travail automatisé a été évaluée en déterminant la limite de détection de la méthode (MDL) et la limite de quantification (LOQ). Il est important de noter que les critères de performance analytique des PFAS peuvent varier en fonction des directives réglementaires spécifiques.
Conformément à la méthode C-010.03 de la FDA américaine, les limites de détection (LD) et les limites de quantification (LQ) sont calculées en multipliant l'écart type d'échantillons de contrôle qualité (CQ) à faible concentration, répétés en série, par des facteurs de 3,14 et 10, respectivement.
Dans cette étude, les LD calculées (LD cal) et les LQ calculées (LQcal) ont été déterminées à partir de neuf réplicas d'échantillons de CQ enrichis à faible concentration (ECQ-FC), à l'exception du FTSA 6:2, pour lequel des échantillons de CQ enrichis à forte concentration (ECQ-FC) ont été utilisés en raison d'effets de matrice.
Globalement, 86 % des analytes cibles ont atteint une LDcal≤ 10 ng/kg et 95 % une LQcal
≤ 50 ng/kg.
Pour les 28 PFAS réglementés par la FDA américaine, les valeurs de LDcal étaient ≤ 10 ng/kg et les valeurs de LQcal ≤ 35 ng/kg. Ces valeurs sont inférieures ou équivalentes aux données de validation publiées par la FDA pour la catégorie des matrices de crustacés.
Ces résultats confirment que le flux de travail automatisé développé pour la quantification des PFAS dans les crevettes est très sensible et répond aux critères de performance analytique validés par la FDA américaine.
Respect des exigences réglementaires relatives aux limites de quantification (LQ)
L'UE, l'EURL POPs et l'AOAC International établissent des LQ requises ou recommandées en fonction de la LQ validée de la méthode, laquelle doit satisfaire à des critères d'identification spécifiques.
Dans cette étude, la LQ validée a été déterminée en fonction du respect simultané des critères suivants :
- Taux de récupération cible compris entre 80 % et 120 % pour le PFOS, le PFNA, le PFOA et le PFHxS ; et entre 65 % et 135 % pour les autres PFAS réglementés.
- Coefficient de variation relatif (CVR) de récupération ≤ 20 %.
- Tolérance du temps de rétention (TR) intra-lot ≤ 1 %. Rapport signal/bruit (S/N) ≥ 3:1.
- Rapport d’intensité des ions (quantificateur/qualificateur) à ± 30 %.
Les limites de quantification (LQ) requises ou recommandées peuvent varier selon les réglementations et les lignes directrices, en fonction du composé PFAS et de la catégorie de matrice de l'échantillon. Une LQ ≤ 0,3 µg/kg est définie ou recommandée pour quatre composés PFAS clés (PFNA, PFOA, PFOS et PFHxS) par les lignes directrices de l'UE, de l'EURL POPs et de l'AOAC pour la catégorie des produits de la mer (y compris les crustacés et les mollusques).
Les lignes directrices de l'AOAC exigent une LQ ≤ 3 µg/kg pour les 26 autres composés PFAS réglementés du même groupe de matrice. Les LQ validées pour les 73 composés sont montrées dans le tableau 2.
Figure 3. Comparaison de sensibilité pour 28 cibles PFAS obligatoires de la FDA américaine en termes de MDL (A) et de LOQ (B).
Comme le montrent les figures 4 et 5, les valeurs de LOQ validées satisfont aux exigences et recommandations de l'UE, de l'EURL, des POP et de l'AOAC pour tous les composés réglementés. Plus précisément, une LOQ validée de 0,1 μg/kg a été obtenue pour le PFOS, le PFNA et le PFOA, soit en dessous de la limite réglementaire. En raison d'un résidu positif élevé de PFHxS détecté dans le blanc de matrice de crevettes, une LOQ validée de 0,3 μg/kg a été obtenue pour le PFHxS, répondant précisément aux spécifications requises/recommandées. Pour les 26 autres cibles obligatoires de l'AOAC, les valeurs de LOQ validées sont inférieures aux LOQ requises (figure 5).
De plus, les valeurs de LOQ validées de la méthode ont été obtenues à partir d'échantillons de contrôle de qualité enrichis, en utilisant une purification μSPE suivie d'une approche de dilution et d'injection sur le système LC/TQ 6495D. Cette approche élimine le besoin de séchage et de reconstitution, offrant un protocole analytique rapide et simplifié. L'ensemble de ces résultats confirme que l'échantillonneur automatique intégré PAL RTC et le système LC/TQ 6495D sont parfaitement adaptés à la réalisation d'un flux de travail automatisé et sensible pour l'analyse des PFAS dans les matrices de crustacés, couvrant à la fois la préparation des échantillons et la quantification des cibles.
Figure 4. Méthode LOQvali
versus exigences/recommandations LOQ pour le PFOA, le PFNA, le PFOS et le PFHxS provenant des POP de l'UE et de l'EURL.
Récupération avec ajout de matrice : Évaluation de l’efficacité et de la précision de l’extraction
Des échantillons de contrôle qualité (CQ) enrichis en matrice ont été utilisés pour évaluer l'efficacité et la précision de l'extraction automatisée des échantillons pour les analytes cibles au sein de la matrice de crevettes. Ces échantillons CQ ont été préparés en enrichissant un mélange de 73 PFAS et de 34 étalons internes (étalons externes extraits (EIS)) à l'aide de l'échantillonneur automatique PAL RTC.
De plus, le mélange standard de performance isotopique EPA 533, contenant trois PFAS marqués (13C3-PFBA, 13C2-PFOA et 13C4-PFOS) et servant d'étalons internes non extraits (NIS), a été ajouté à l'extrait final de l'échantillon après purification par μSPE (comme illustré à la figure 10). Des échantillons de contrôle qualité (CQ) ont été préparés à trois niveaux de concentration : faible (FQ, 0,1 µg/kg), moyenne (FQ, 0,3 µg/kg) et élevée (FQ,1,0 µg/kg).
Chaque niveau de CQ a été préparé en double à l’aide du flux de travail automatisé complet. La concentration mesurée de chaque analyte dans les échantillons de CQ a été corrigée en soustrayant toute quantité détectée dans l’échantillon témoin de crevettes non enrichi (si la concentration était supérieure à la limite de détection).
Le taux de récupération de la méthode pour chaque CQ a été calculé comme le pourcentage moyen de récupération (n = 6, représentant trois injections pour chacune des préparations en double).
Des taux de récupération compris entre 65 % et 135 % ont été obtenus pour la majorité des analytes : 79 % à FQ, 89 % à FQ et 92 % à FQ.
Ces résultats démontrent la haute efficacité d’extraction et la précision du flux de travail automatisé pour les PFAS dans les échantillons de crevettes.
Figure 5. Méthode LOQvali versus exigences LOQ pour 30 analytes PFAS obligatoires de l'AOAC.
La figure 6 présente la distribution des taux de récupération des PFAS obligatoires au niveau MSQ, qui était égal ou inférieur à la limite de quantification (LQ) conformément aux exigences et recommandations de l'UE, de l'EURL POPs et de l'AOAC. Pour les composés clés PFOS, PFNA, PFOA et PFHxS, les taux de récupération au niveau MSQ se situaient tous dans la plage acceptable de 80 % à 120 %.
Pour les 26 autres composés requis par l'AOAC, les taux de récupération variaient de 71 % à 99 %, respectant les lignes directrices/exigences de 65 % à 135 %. En raison d'interférences importantes de la matrice des échantillons de crevettes, affectant les taux de récupération LSQ et MSQ pour le FTSA 6:2, le niveau HSQ (1,0 µg/kg) a été utilisé pour ce composé. Cette concentration HSQ était encore trois fois inférieure à la LQ de 3 µg/kg pour le FTSA 6:2 dans les lignes directrices de l'AOAC.
Ces résultats de récupération soulignent l'excellente performance du flux de travail automatisé mis en œuvre sur l'échantillonneur automatique PAL RTC et le système LC/TQ 6495D. Ce flux de travail offre une efficacité de préparation des échantillons supérieure grâce à l'extraction par solvant, au relargage QuEChERS et à la purification par μSPE pour l'analyse des PFAS dans des matrices complexes de produits de la mer. Bien qu'une interférence significative de la matrice ait affecté l'intégration de la cible, entraînant une faible récupération (42 % à 55 %) du diSAmPAP lors des analyses inter-lots, et que la récupération n'ait pas été déterminée pour le PFBPA, le 10:2 FTCA, le 8:2 FTCA et le 6:2 FTCA, il est important de noter que ces composés ne sont actuellement répertoriés dans aucune des directives réglementaires ou méthodes décrites dans cette note d'application.
Répétabilité et reproductibilité de la méthode : Évaluation de la cohérence et de la robustesse
La répétabilité (RSDr) et la reproductibilité (RSDR) de l'ensemble du flux de travail ont été évaluées à l'aide de l'écart type relatif (RSD) des récupérations de contrôle qualité ajoutées à partir d'analyses intra-lot et inter-lot, respectivement.
Répétabilité (RSDr)
Le RSDr a été calculé à partir d'injections tripliquas de préparations en double (n = 6) au sein d'un même lot pour les niveaux LSQ, MSQ et HSQ. Plus de 93 % des analytes cibles ont atteint un SDr ≤ 19 % pour les trois niveaux de contrôle qualité, satisfaisant ainsi au critère d'acceptation de ≤ 20 % établi par l'EURL POPs, la FDA américaine et l'AOAC.
De plus, un RSDr ≤ 12 % a été obtenu pour les 30 PFAS analytes réglementés par l'UE, l'EURL POPs et l'AOAC. La figure 7 présente les chromatogrammes MRM superposés de six injections issues de deux préparations techniques de (A) PFNA au niveau LSQ, (B) PFOS au niveau LSQ et (C) PFOA au niveau MSQ.
Ces concentrations étaient équivalentes à leurs limites de quantification (LQ) respectives validées (indiquées dans le tableau 2). Le coefficient de variation relatif (CVR) des taux de récupération pour le PFNA, le PFOS et le PFOA était ≤ 3 %, démontrant une excellente répétabilité intra-lot, tant au sein d'un même flacon (injection) et entre flacons (préparation à préparation), à l'aide de l'échantillonneur automatique PAL RTC et du système LC/TQ 6495D. Les données de répétabilité de récupération n'étaient pas disponibles pour le PFBPA, le 10:2 FTCA, le 8:2 FTCA et le 6:2 FTCA en raison de taux de récupération indéterminés causés par une interférence matricielle importante dans la matrice de crevettes.
Figure 6. Distribution de la récupération MSQ des PFAS obligatoires provenant de l'UE, des POP de l'EURL et de l'AOAC (*la récupération HSQ pour le FTSA 6:2 a été utilisée). La limite de récupération est indiquée par une ligne pointillée rouge.
Reproductibilité (RSDr)
Le RSDR (taux de récupération inter-lots) a été utilisé pour évaluer la robustesse quotidienne du flux de travail automatisé. Le RSDR a été déterminé à partir d'échantillons MSQ (sauf pour le FTSA 6:2, où le HSQ a été utilisé) et calculé à partir des taux de récupération moyens de trois lots consécutifs (n = 3) analysés à des jours différents.
Un RSDR ≤ 20 % a été atteint pour 68 des 73 analytes cibles (93 %), démontrant ainsi la grande fiabilité des résultats analytiques pour la grande majorité des PFAS avec ce système entièrement automatisé. Les 30 composés PFAS réglementés ont atteint un RSDR ≤ 12 % (Figure 8). Ceci satisfait à l'exigence de ≤ 20 % pour les quatre PFAS critiques (PFOS, PFOA, PFNA et PFHxS) selon les EURL POPs, et de ≤ 40 % pour tous les PFAS réglementés selon les directives de l'AOAC.
Ces résultats confirment que le flux de travail automatisé, mis en œuvre sur l'échantillonneur automatique PAL RTC et le système LC/TQ 6495D, est reproductible, fiable et robuste pour la gestion des tâches analytiques complexes requises pour l'analyse des PFAS dans les matrices de produits de la mer difficiles.
Figure 7. Six injections superposées de traces MRM de (A) PFNA à LSQ, (B) PFOS à LSQ et (C) PFOA à MSQ à partir de deux préparations techniques au sein d'un lot analytique.
Figure 8. Reproductibilité de la récupération inter-lots (RSDR) à la concentration minimale de référence (MSQ) (0,3 μg/kg) pour les 30 PFAS réglementés (*la concentration minimale de référence (HSQ) à 1,0 μg/kg a été utilisée pour calculer la RSDR du 6:2 FTSA). La limite de la RSDR est indiquée par une ligne rouge pointillée.
Conclusion
Une solution robuste et automatisée pour l'analyse des PFAS dans les produits de la mer
Cette note d'application présente une méthode analytique entièrement automatisée pour la quantification précise et fiable des substances per- et polyfluoroalkylées (PFAS) dans les produits de la mer.
La méthode intègre un passeur d'échantillons automatique PAL RTC à un système LC/MS à triple quadripôle Agilent 6495D, transférant ainsi efficacement les tâches fastidieuses – notamment la préparation des solutions étalons, l'extraction des échantillons et l'analyse des composés – à un système robotisé. Le passeur d'échantillons automatique PAL RTC a automatisé avec succès l'extraction par solvant assistée par relargage QuEChERS et la purification par micro-extraction en phase solide (μSPE), éliminant ainsi les étapes manuelles fastidieuses de la préparation des échantillons. La méthode a démontré d'excellentes performances pour les principaux paramètres analytiques : linéarité, sensibilité (faibles limites de détection et de quantification), exactitude (démontrée par les taux de récupération après ajout de matrice), répétabilité et reproductibilité. Elle a systématiquement satisfait, voire dépassé, les exigences réglementaires et les recommandations strictes relatives à l'analyse des PFAS dans les produits de la mer, établies par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, l'Union européenne (UE), le Laboratoire de référence de l'UE pour les polluants organiques persistants halogénés (EURL POPs) et l'Association of Official Analytical Chemists (AOAC) International. Il convient de noter que la méthode a également démontré sa performance pour répondre aux exigences spécifiques relatives à l'analyse des PFAS dans d'autres matrices complexes, telles que les œufs, le café, l'huile de poisson et les aliments pour animaux.
Les principaux avantages de ce flux de travail automatisé sont les suivants :
• Intervention manuelle réduite : minimisation des erreurs humaines et amélioration de la précision et de la fiabilité de l’analyse.
• Débit accru : Le traitement parallèle de la préparation des échantillons et de l’acquisition des données simplifie le flux de travail et améliore considérablement la productivité du laboratoire.
• Résultats cohérents et reproductibles : L’intégration de techniques automatisées avancées de préparation des échantillons avec un système LC/TQ haute sensibilité garantit des résultats cohérents et reproductibles, essentiels au respect des exigences réglementaires.
• Rentabilité : L’automatisation des tâches à forte intensité de main-d’œuvre permet de réduire le coût par échantillon.
Matériel et méthode
Produits et réactifs
Le méthanol (MeOH) et l'acétate d'ammonium de qualité LC/MS, adaptés aux applications de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse, ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis). L'acétonitrile (ACN) et l'eau (H₂O) ultrapurs de qualité LC/MS ont été fournis par Agilent (références 5191-4496 et 5191-4498). Les standards de PFAS natifs (non marqués) et marqués isotopiquement ont été obtenus auprès de Wellington Laboratories Inc. (Guelph, ON, Canada) et de Toronto Research Chemicals (Toronto, ON, Canada). Ces standards étaient fournis sous forme de solutions mères, de solutions pré mélangées ou de poudres.
Consommables
Le choix des consommables appropriés est crucial pour l'analyse des PFAS à l'état de traces, car les matériaux utilisés peuvent affecter significativement les concentrations de fond de PFAS, pouvant ainsi conduire à des résultats faussement positifs. Par conséquent, tous les consommables utilisés dans ce travail ont été rigoureusement testés et vérifiés afin de garantir un niveau de fond de PFAS extrêmement faible. [8] De plus, l'échantillonneur automatique PAL peut également être équipé pour l'analyse des PFAS.
Les consommables suivants ont été utilisés :
• Sachets de sel d’extraction Agilent QuEChERS, conformes à la méthode EN 15662 (référence 5982-6650).
• Cartouches d’extraction en phase solide micro (μSPE) Agilent (référence G6074-67013).
• Flacons en polypropylène sans PFC Agilent, 2 ml (référence 5191-8150) – L’absence de PFC indique l’absence de composés polyfluorés, minimisant ainsi les risques de contamination.
• Flacons et bouchons en polypropylène Agilent, 250 µl (références 5190-2242 et 5191-8151).
• Colonne Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 (2,1 × 100 mm, granulométrie de 1,8 μm, référence 959758-902).
Présentation du système
L’analyse a été réalisée à l’aide d’un système entièrement intégré et automatisé, composé d’un passeur d’échantillons automatique PAL RTC (CTC Analytics AG) et d’un système LC/MS à triple quadripôle Agilent 6495D (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem, LC/TQ) (Figure 9).
Figure 9. Échantillonneur automatique PAL3 série 2 RTC avec un LC/MS triple quadripôle Agilent 6495D.
Configuration de l'échantillonneur automatique PAL RTC
Un échantillonneur automatique PAL RTC de 160 cm a été utilisé pour la manipulation automatisée des liquides. Ces manipulations incluaient la préparation des solutions étalons, l'extraction des échantillons et leur injection dans le système LC/TQ. L'échantillonneur automatique PAL RTC était configuré avec les outils et modules suivants :
• Deux stations park, équipées de trois seringues à liquide, d'un dilueur, d'un outil μSPE et d'un outil LC/MS.
• Agitateur vortex.
• Centrifugeuse.
• Dilueur multiple.
• Refroidisseur de plateaux (pour flacons de 2/10/20 ml).
• Porte-plateaux avec rack R60 (pour flacons de 10/20 ml).
• Plateau μSPE (pour flacons de 2 ml et cartouches d'extraction en phase solide micro).
• Module solvant et module de lavage rapide.
• Vanne d'injection LC.
La vanne d'injection LC a été intégrée à l'échantillonneur automatique PAL RTC, et toutes les seringues à liquide ont été nettoyées automatiquement à l'aide du module de lavage rapide. Tous les tubes de solvant de l'échantillonneur automatique PAL RTC étaient exempts de PFAS afin de prévenir toute contamination. La modularité du système permet l'ajout d'autres outils et modules pour répondre aux besoins spécifiques de préparation des échantillons.
Composants et paramètres du système LC/TQ
La séparation chromatographique a été réalisée à l'aide d'une colonne Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 (2,1 × 100 mm, granulométrie de 1,8 μm) installée sur un système UHPLC Agilent 1290 Infinity II.
Le système UHPLC était composé de :
• Pompe haute vitesse Agilent 1290 Infinity II (référence G7120A).
• Thermostat multicolonne Agilent 1290 Infinity II (référence G7116B).
Un passeur d'échantillons Agilent 1290 Infinity II n'était pas nécessaire, car le passeur d'échantillons automatique PAL RTC a géré toutes les étapes de manipulation et d'injection des échantillons. Afin de minimiser la contamination de fond par les PFAS provenant du système LC ou des phases mobiles, un kit de conversion HPLC sans PFC Agilent InfinityLab (référence 5004-0006) a été installé.
Ce kit comprend des têtes de flacons sans PFC, un adaptateur de tête de pompe, un filtre en ligne, une tubulure de lavage multiple et une colonne de temporisation. Une élution en gradient de 12 minutes, décrite en détail dans la base de données Agilent PFAS MRM pour LC/TQ (référence G1736AA), a été utilisée. La phase mobile A était composée d'acétate d'ammonium 5 mM dans l'eau, et la phase mobile B était du méthanol pur, avec un débit de 0,4 ml/min.
Paramètres du spectromètre de masse
Un spectromètre de masse à triple quadripôle Agilent 6495D (LC/TQ), équipé d'une source d'ions Agilent Jet Stream Technology (AJS), a été utilisé pour la détection des PFAS cibles. L'instrument a fonctionné en mode d'ionisation négative. Un réglage automatique a été effectué en mode quadripôle standard afin d'optimiser les paramètres de l'instrument.
Le tableau 1 présente la liste détaillée des conditions de fonctionnement et des paramètres. L'échantillonneur automatique PAL RTC intégré et le système LC/TQ 6495D étaient contrôlés par le logiciel d'acquisition Agilent MassHunter pour systèmes LC/MS (version 12.1 mise à jour 3). L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel d'analyse quantitative Agilent MassHunter (version 12.1).
Tableau 1. Conditions de fonctionnement de l'instrument et paramètres de la source MS.
Flux de travail automatisé : Procédure étape par étape, de l’étalonnage à l’analyse de l’échantillon
Cette section décrit la procédure entièrement automatisée pour la quantification des PFAS dans une matrice de crevettes. Le flux de travail comprend la préparation automatisée des solutions étalons, suivie de la préparation et de l'analyse automatisées des échantillons.
Préparation automatisée des étalons d'étalonnage
L'échantillonneur automatique PAL RTC a été programmé pour préparer automatiquement une série de 12 niveaux d'étalonnage. Trois solutions mères intermédiaires ont été préparées manuellement :
• Un mélange contenant les 73 analytes PFAS.
• Un mélange contenant 34 étalons de substitution.
• Un mélange contenant trois étalons internes (ISTD).
Toutes les solutions mères ont été préparées dans un mélange de solvants ACN:MeOH:H₂O (60:15:25, v/v/v), qui a également servi de diluant tout au long de l'expérience. L'échantillonneur automatique PAL RTC a ensuite créé quatre sous-mélanges (désignés A, B, C et D) à partir de la solution mère d'analytes par dilutions successives.
Les 12 solutions d'étalonnage ont ensuite été préparées à partir de ces sous-mélanges, avec des quantités constantes d'étalons de substitution et d'ISTD ajoutées à chaque niveau. Un blanc d'étalonnage, contenant uniquement les étalons de substitution, les ISTD et le mélange de solvants, a également été préparé. Toutes les solutions préparées (solutions mères, sous-mélanges et solutions étalons) ont été conservées dans le portoir réfrigéré PAL à 5 °C afin de maintenir la stabilité des composés PFAS et d'éviter l'évaporation. Une fois les solutions étalon préparées, le système a automatiquement lancé l'analyse de la gamme complète d'étalonnage.
Préparation automatisée des échantillons
La crevette, un crustacé typique et une matrice réglementée par la FDA américaine, l'UE, l'EURL POPs et l'AOAC, a été sélectionnée pour évaluer les performances de la procédure d'extraction automatisée (Figure 10). La méthode utilise l'extraction par solvant suivie d'un relargage QuEChERS, une technique largement reconnue et acceptée pour l'analyse des PFAS dans les matrices alimentaires [2,7,10]. Afin de minimiser les interférences avec la quantification des PFAS, les différents flacons et bouchons utilisés dans cette étude ont été rigoureusement testés avant leur intégration dans le flux de travail automatisé.
Prétraitement des échantillons (étape manuelle) : Des crevettes fraîches ont été achetées dans une épicerie locale, coupées en petits morceaux et congelées à -20 °C. Les échantillons congelés ont ensuite été broyés pour obtenir une poudre fine. Environ 4 ± 0,1 g de cette poudre de crevettes ont été pesés manuellement dans un flacon d'échantillon de 20 ml et placés dans le refroidisseur à plateaux PAL, réglé à 5 °C, afin de maintenir des conditions optimales pour l'extraction ultérieure.
Étapes d'extraction automatisées (réalisées par l'échantillonneur automatique PAL RTC, comme illustré à la figure 10) :
1. Ajout : Un mélange d'étalons internes (servant d'étalons internes extraits, EIS) a été ajouté au flacon d'échantillon. Si des échantillons de contrôle de qualité (CQ) enrichis dans la matrice étaient nécessaires, les analytes cibles PFAS ont également été ajoutés à ce stade. [2,11] Pour cette étude, des échantillons CQ à faible (FQ, 0,1 µg/kg), moyenne (FQM, 0,3 µg/kg) et forte (FQH, 1,0 µg/kg) concentration d'analyte ont été préparés en double. Un blanc de matrice (BM), ne contenant aucun analyte cible ajouté, a également été préparé.
2. Extraction par solvant : 8 ml de solvant d’extraction (ACN:H₂O, 50:50, v/v) ont été ajoutés au flacon d’échantillon à l’aide de l’outil de dilution PAL. Le flacon a ensuite été vigoureusement vortexé à 2 000 tr/min en mode pulsé.
3. Centrifugation : Le flacon d’échantillon a été centrifugé à 4 500 tr/min pendant 3 minutes.
4. Transfert du surnageant : 1 ml du surnageant (la couche liquide claire) a été transféré dans un flacon en polypropylène de 2 ml contenant des sels QuEChERS préalablement pesés. Le flacon a été immédiatement vortexé.
5. Seconde centrifugation : Le flacon de 2 ml a été centrifugé une seconde fois.
6. Conditionnement de la cartouche μSPE : une cartouche d’extraction en phase solide à micro-échelle (μSPE) a été conditionnée avec 100 μl d’acétonitrile (ACN) et égouttée à l’air comprimé.
7. Purification de la cartouche μSPE : 150 μl de l’extrait provenant du flacon de 2 ml ont été transférés dans la cartouche μSPE conditionnée. La cartouche a été placée sur un flacon d’injection en polypropylène de 250 μl (muni d’un bouchon pré-découpé). L’extrait a été chargé avec précaution à travers la cartouche μSPE à un débit de 5 μl/s. L’éluat (l’extrait purifié) a été recueilli dans le flacon d’injection par soufflage d’air comprimé.
8. Ajout d’étalons internes : une quantité précise d’étalons internes non extraits (ISTD) a été ajoutée au flacon d’injection. Le flacon a ensuite été rempli jusqu'à un volume final de 250 μl avec du diluant.
9. Mélange final et injection : Le mélange a été vortexé, et 10 μl ont été injectés directement dans le système LC/TQ 6495D.
Figure 10. Préparation automatisée d'échantillons pour matrice de crevettes par l’automate CTC PAL3 Series 2 RTC.
Avantages de la procédure automatisée
Ce flux de travail automatisé élimine les étapes de séchage et de reconstitution, réduisant considérablement le temps de préparation des échantillons et minimisant les pertes potentielles d'analyte dues au chauffage ou à l'évaporation. Après chaque cycle de préparation d'échantillon, l'outil LC/MS de l'échantillonneur automatique PAL RTC était automatiquement transféré vers le module de lavage rapide pour un post-lavage avec les solvants S1 et S2 (comme détaillé dans le tableau 1). L'échantillonneur automatique PAL RTC était alors prêt pour le cycle de préparation d'échantillon suivant, tandis que le système LC/TQ enregistrait les données de l'échantillon précédent.
Séquence d'analyse en ligne et traitement parallèle
L'ensemble du flux de travail automatisé était géré par le logiciel Agilent MassHunter, permettant la création d'une liste de travail d'analyse en ligne (Figure 11). Une liste de travail type comprend des solutions étalons, un blanc réactif (BR), un blanc de matrice (BM), des échantillons de contrôle qualité (CQ) enrichis en matrice (optionnels) et des échantillons inconnus (1 à n). Le blanc réactif (BR), également appelé blanc de procédure, était préparé sans matrice d'échantillon afin de contrôler toute contamination potentielle tout au long du processus d'extraction. Comme illustré sur la Figure 11, l'échantillonneur automatique PAL RTC commençait par préparer les solutions étalons. Avant l'analyse des solutions étalons, un blanc de solvant était injecté et analysé afin d'évaluer la qualité du solvant et la contamination de fond. Une fois les analyses d'étalonnage terminées, l'échantillonneur automatique PAL RTC lançait la préparation du BR, suivie de l'analyse par LC/TQ. Simultanément, l'échantillonneur automatique PAL RTC procédait à la préparation de l'échantillon suivant sans interrompre l'acquisition des données LC/TQ en cours. Cette capacité de traitement parallèle de l'échantillonneur automatique PAL RTC intégré et du système LC/TQ 6495D améliore considérablement la productivité du laboratoire en éliminant le temps d'attente entre les analyses.
Figure 11. Séquence d'analyse en ligne sur l'échantillonneur automatique intégré CTC PAL3 Series 2 RTC et la LC/MS triple quadripôle Agilent 6495D.
Tableau 2. Résumé de la linéarité de la méthode, de la limite de détection (LD), de la limite de quantification (LQ) et des exigences/recommandations réglementaires. Les cibles surlignées en bleu sont actuellement répertoriées dans les normes suivantes : FDA (États-Unis), UE, POPs de l’UE et AOAC.
NA : Non disponible dans la réglementation/les lignes directrices.
ND : Non déterminé par la méthode.
Références
(1) U.S. Food and Drug Administration. FDA Shares Results on PFAS Testing in Seafood; U.S. Food and Drug Administration: 2022. (consulté le 2024-10-27). https:// www.fda.gov/food/hfp-constituent-updates/fda-shares-results-pfas-testing-seafood
(2) U.S. Food and Drug Administration. Foods Program Compendium of Analytical Laboratory Methods: Chemical Analytical Manual (CAM); U.S. Food and Drug Administration. (consulté le 2024-10-27).www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/foods-program-compendiumanalytical-laboratory-methods
(3) Commission Regulation (EU) 2023/915 of 25 April 2023 on maximum levels for certain contaminants in food and repealing Regulation (EC) No 1881/2006 Textwith EEA relevance, Official Journal of the European Union, 2023. (consulté le 2024-10-27). http://data.europa.eu/eli/">http://data.europa.eu/eli/
(4) Commission Recommendation (EU) 2022/1431 of 24 August 2022 on the monitoring of perfluoroalkyl substances in food, Official Journal of the European Union,2022. (consulté le 2024-10-27). http://data.europa.eu/
(5) European Union Reference Laboratory for Halogenated Persistent Organic Pollutants in Feed and Food. Guidance Document on Analytical Parameters for the Determination of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS) in Food and Feed, version 1.2; EURL POPs, 2022. consulté le 2024-10-27).https://eurl-pops.eu/user/page...
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(7) European Union Reference Laboratory for Halogenated Persistent Organic Pollutants in Feed and Food. ANNEX: Example of Methodology for the Determination of PFAS in Food and Feed, version 1.0; EURL POPs, 2022. (consulté le 2024-10-27). www.food.ec.europa.eu/document/download/e3d57367-a3b6-4429-9e47-fc92d5bf83b1_en?filename=cs_ contaminants_sampling_guid-doc-analyt-para-annex.pdf
(8) Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS) Analysis for Environmental Samples; Agilent Technologies Consumables Ordering Guide, Publication Number 5994-2357EN; Agilent Technologies, 2024.
(9) Kamuf, M.; Walz, M.; Borowiak, A. Reduce PFAS Background with the Agilent PFC-Free HPLC Conversion Kit*; Agilent Technologies Technical Overview, PublicationNumber 5994-2291EN; Agilent Technologies, 2024.
(10) Zhao, L.; Giardina, M.; Parry, E. Determination of 30 Per- and Polyfluoroalkyl Substances in Beef, Tuna, and Shrimp; Agilent Technologies Application Note, Publication Number 5994-7368EN; Agilent Technologies, 2024.
(11) U.S. Environmental Protection Agency. EPA Method 1633: Analysis of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS) in Aqueous, Solid, Biosolids, and Tissue Samples by LC-MS/MS; U.S. EPA: Washington, DC, 2024.