Analyse de la composition en acide gras
Analyse de la composition en acides gras dans les huiles raffinées et les graisses par transestérification basique
Pour plus de détails sur notre solution clé en main pour l’analyse des EMAGs (FAMEs), cliquer ici.
Introduction
Les graisses animales et végétales jouent un rôle important en tant que composant de notre alimentation quotidienne.
Conformément au règlement de l’UE sur l’information alimentaire, les fabricants de produits alimentaires sont obligés d’indiquer la composition en acides gras sur l’emballage depuis décembre 2016. Pour cette déclaration, non seulement la composition en acides gras des graisses et des huiles est déterminée, mais aussi celle des acides gras cis et trans. De plus, le degré de pureté est mesuré.
Cependant, les triglycérides des acides gras ne peuvent pas être analysés par chromatographie en phase gazeuse. Cela nécessite une hydrolyse et une dérivatisation des graisses. Les liaisons esters sont rompues et les acides gras libres sont convertis en leurs esters méthyliques correspondants. Contrairement aux acides gras correspondants, les esters méthyliques d’acides gras (EMAGs ou FAMEs) sont non polaires, modérément volatils et adaptés à l’analyse par chromatographie en phase gazeuse.
Il existe différentes réglementations décrivant l’analyse d’échantillons contenant de l’huile pour les FAMEs (ou EMAGs). La norme Ce 2-66 de l’American Oil Chemists’ Society (AOCS) sert de modèle pour l’application présentée ici. Cette norme contient plusieurs méthodes pour le traitement des échantillons de graisse, les méthodes 3 et 4 étant utilisées pour l’automatisation. La méthode 4 est utilisée pour le traitement des échantillons de graisse avec un nombre d’acide inférieur à 2. La méthode 3, quant à elle, est une méthode de traitement plus complète. Cependant, elle est également plus complexe et chronophage.
La méthode listée dans la norme DGF C-VI 11(a) correspond à la préparation des échantillons selon la méthode 3, et la méthode DGF C-VI 11(d) à la méthode 4.
Configuration de l’instrument
L’analyse des acides gras (EMAGs ou FAMEs) d’une graisse a été réalisée sur un système capable d’effectuer à la fois la préparation de l’échantillon et l’analyse de manière entièrement automatique. Un système GC-FID 8890A d’Agilent Technologies équipé d’un injecteur S/SL et d’une colonne BPX-70 de 60 m a été utilisé à cet effet. Un échantillonneur automatique CHRONECT Robotic RTC a été utilisé pour la préparation des échantillons. Le logiciel CHRONOS d’Axel Semrau a été utilisé pour contrôler l’ensemble du système.
Paramètres de mesure et résultats
La mise en place d’une solution pour la préparation d’échantillons selon l’AOCS Ce 2-66 avec deux variantes de préparation d’échantillons nécessite un système flexible pour l’automatisation. L’échantillonneur CHRONECT Robotic RTC développé par la société Axel Semrau avec changement d’outil automatique le permet. Grâce à deux supports pour outils, il est possible d’utiliser jusqu’à 6 outils avec différentes seringues pour diverses tâches sur le système. Cela offre le plus haut niveau d’efficacité et de flexibilité, tout en aidant à éviter la contamination croisée.
Combinée à la plateforme logicielle CHRONOS, cette solution offre une automatisation puissante avec une planification intelligente, une superposition des tâches et une utilisation optimale de l’ensemble du système. La préparation des échantillons et l’analyse des acides gras (EMAGs ou FAMEs) est entièrement automatisée grâce à cette technologie.
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Les paramètres de mesure du chromatographe en phase gazeuse pour les échantillons préparés ont été sélectionnés à partir de la norme AOCS Ce 1f-96. Cette norme décrit uniquement les conditions chromatographiques pour l’analyse des esters méthyliques d’acides gras (EMAGs ou FAMEs).
La méthode 3 décrit la préparation des échantillons par saponification alcaline à l’aide d’hydroxyde de sodium méthanolique (NaOH méthanolique) suivie d’une méthylation avec du trifluorure de bore méthanolique (BF3 méthanolique). Le mélange est ensuite chauffé à ébullition et dilué avec du n-heptane. Cela est suivi d’une autre phase d’ébullition, puis d’une précipitation avec du chlorure de sodium saturé. Deux phases se forment, et la phase organique supérieure est séchée avec du sulfate de sodium, puis injectée dans le GC-FID.
La transestérification a lieu entièrement dans un flacon de 10 mL contenant l’échantillon, et le séchage ultérieur de l’échantillon sur sulfate de sodium est effectué dans un flacon de 2 mL. Grâce au changement d’outil robotique (RTC), l’échantillonneur offre la meilleure solution pour préparer ces échantillons sans contamination croisée, tout en automatisant complètement le processus. Le résultat d’analyse d’un échantillon d’huile d’olive préparé par cette méthode est présenté dans le tableau suivant.
| Composés | Aire relative (%) | Valeur de référence |
| C16:0 (acide palmitique) | 11.4 | 7.5 – 20.0 |
| C18:1 (acide oléique) | 76.0 | 55.0 – 83.0 |
| C18:2 cc | 6.1 | 3.5 – 21.0 |
| Autres acides gras | 6.4 | 0.0 – 10.0 |
En utilisant la plateforme CHRONOS en combinaison avec le RTC, il est possible de préparer jusqu’à 100 échantillons d’huile en 24 heures et de les analyser par GC-FID.
Dans la méthode 4 de la norme AOCS Ce 2-66, la transestérification d’environ 50 mg d’échantillon est réalisée à l’aide d’hydroxyde de potassium méthanolique (KOH méthanolique). Tout d’abord, l’échantillon est dissous dans du n-heptane. Après séparation des phases, la phase organique est lavée à l’eau et séchée avec du bisulfate de sodium. L’extrait sec est dissous dans du n-heptane et injecté directement depuis le flacon dans le système GC-FID.
Une procédure de préparation d’échantillons pour la méthode 4 est présentée dans le tableau suivant et inclut toutes les étapes principales. Ce type de préparation est idéal pour traiter des échantillons d’huile dans un délai court.
| Tâche | Description |
| Transfert | Ajouter du n-heptane |
| Transfert | Ajouter du KOH méthanolique à 2 M |
| Vortex Flacon | Bien agiter l’échantillon |
| Attendre (Superposé) | Attendre la séparation des phases |
| Transfert | Transférer 0,5 mL d’eau dans le flacon suivant |
| Transfert | Transférer 0,5 mL de la phase supérieure dans le flacon suivant |
| Vortex Flacon | Bien agiter l’échantillon |
| Attendre (Superposé) | Attendre la séparation des phases |
| Transfert | Transférer 2 gouttes de la phase supérieure sur du sulfate de sodium |
| Transfert | Diluer avec du n-heptane |
| Vortex Flacon | Bien agiter l’échantillon |
Si nécessaire, la préparation des échantillons peut être accélérée en utilisant une centrifugeuse pour obtenir une séparation des phases plus rapide. Le temps de traitement par échantillon peut être réduit à un total de 15 minutes si des flacons de 10 mL sont utilisés. La quantité de solvants, en particulier d’heptane, est augmentée afin d’accélérer la séparation des phases.
Une attention particulière doit être apportée au rinçage de toutes les seringues utilisées. Celui doit être suffisant pour éviter la contamination croisée entre les différents échantillons et pour obtenir une bonne séparation des phases lors de la précipitation des triglycérides.
En plus de développer la méthode de préparation des échantillons, les paramètres du système GC-FID Agilent ont été ajustés pour obtenir une séparation satisfaisante des esters méthyliques d’acides gras (EMAGs ou FAMEs). À cet effet, un étalon FAME comportant 11 composés allant de C14:0 à C24:0 a été injecté et le programme de température a été ajusté en conséquence.
Pour le développement de la méthode, des solutions étalons composées de onze différents esters méthyliques d’acides gras ont été analysées.
Avec les paramètres GC mentionnés précédemment, une bonne séparation de tous les analytes a pu être réalisée. Même les composés C18:3 et C20:0 montrent une séparation appropriée.
De plus, l’étalon Restek FAME 37 a été injecté, comprenant un total de 37 esters méthyliques d’acides gras, afin d’obtenir une calibration plus précise du temps de rétention pour les différents acides gras. Le chromatogramme montre la plage allant de C14:0 à C24:1 avec un nombre de signaux correspondants dans cette plage.
Pour la validation de la méthode complète, un échantillon réel a ensuite été mesuré, avec des caractéristiques connues. Une comparaison de la composition en acides gras avec les données de référence a montré seulement de légères déviations par rapport aux données fournies avec l’échantillon.
L’analyse entièrement automatisée d’un échantillon d’huile fournit donc des données comparables à celles de la préparation manuelle des échantillons. Les dérives des données obtenues par rapport à celles du fabricant d’huile sont clairement dans la marge d’erreur du processus, qui peut atteindre jusqu’à 20 % pour certains composés avec un faible ratio signal sur bruit.
Résumé
L’automatisation de l’analyse des esters méthyliques d’acides gras (EMAGs ou FAMEs) selon la norme AOCS présentée ici permet de réaliser l’analyse complète d’un échantillon d’huile de manière entièrement automatique. La préparation manuelle des échantillons est réduite au changement de solvant et à la pesée manuelle de l’échantillon d’huile. La manipulation de l’échantillon et des produits chimiques est entièrement assurée par le robot, ainsi que l’injection automatique dans le système GC-FID.
De plus, la quantité d’échantillon et de produits utilisés est réduite à quelques millilitres par analyse. Le danger pour le personnel de laboratoire est significativement réduit, car il est moins en contact avec des produits dangereux.
Le changement des produits sur le robot lui-même peut être effectué une fois par jour et consiste à recharger les solutions de lavage et éventuellement à compléter les réactifs. Seules des matrices plus complexes, comme les aliments pour animaux et les solides en général, peuvent nécessiter un prétraitement supplémentaire.
L’automatisation garantit que l’analyse peut être réalisée sans contamination croisée et permet également d’atteindre une cadence élevée. La préparation des échantillons via la solution CHRONECT Robotic d’Axel Semrau est robuste et peut être opérée 24 heures sur 24. La productivité est grandement améliorée par rapport à la préparation manuelle des échantillons.
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